• <menu id="mge00"><strong id="mge00"></strong></menu>
  • 康復醫學論文欄目提供最新康復醫學論文格式、康復醫學碩士論文范文。詳情咨詢QQ:357500023(論文輔導)

    硫化氫通過硫巰基化MDM2抑制肺上皮細胞的衰老從而改善博來霉素誘導的小鼠肺纖維化

    日期:2021年05月14日 編輯:ad201107111759308692 作者:無憂論文網 點擊次數:56
    論文價格:150元/篇 論文編號:lw202104301012309432 論文字數:25655 所屬欄目:康復醫學論文
    論文地區:中國 論文語種:中文 論文用途:碩士畢業論文 Master Thesis

    本文是一篇康復醫學論文,筆者認為H2S 通過硫巰基化 MDM2 促進 P53 的泛素化降解,從而改善了 BLM 誘導的肺纖維化。在后續的實驗中,我們將通過突變 MDM2蛋白上的潛在硫巰基化位點觀察 MDM2 硫巰基化以及 P53 泛素化降解水平是否下降來進一步明確 H2S 是否通過硫巰基化 MDM2 發揮作用。


    1、前言


    肺纖維化是在肺部疾病中常見的一種典型的病理特征[1]。特發性肺纖維化(IPF)是其中最為常見的。其同時也是致死率最高的間質性肺疾病,其確診以后患者的中位生存率僅為 2 至 5 年。目前對于肺纖維化的發病機制還沒有足夠的了解,因此除了肺部移植以外對于這種疾病并沒有有效的治療措施[2]。目前認為 IPF 發病機制主要是肺泡上皮細胞(AEC)損傷和成纖維細胞活化。

    細胞衰老是一個極其復雜的病理生理過程,即細胞從正常生長狀態變為不可逆的生長停滯狀態的過程。越來越多的證據表明細胞衰老與機體功能老化以及老化引起的疾病包括肺纖維化有關聯。細胞衰老主要受 P53 / P21 和 P16 /PRb 通路調節,P53 / P21 和 P16 / PRb 通路可協調或獨立調節細胞衰老過程。然而我們對于細胞衰老的機制還不夠了解。II 型肺上皮細胞可以自我更新還可以分化為 I 型肺泡上皮細胞。因此,ATII 細胞被認為是肺泡祖細胞[3,4]。II型肺上皮細胞的衰老也是肺纖維化包括 IPF 的重要發病機制[5,6,7,8]。對于 II 型肺泡上皮細胞衰老的深入了解有助于我們理解肺纖維化的病理機制并且提出相對應的有效治療措施。

    硫化氫(H2S)被認為是繼一氧化氮和一氧化碳之后氣體傳輸家族的第三成員,它在包括炎癥[9],代謝紊亂[10]和血壓調節[11]等許多生理和病理生理過程中都起著極其重要的作用。在哺乳動物組織中,內源性 H2S 主要來自于半胱氨酸β-合酶(CBS)和半胱氨酸-y-裂解酶(CSE)[12]。最近有實驗檢測到了 CBS和 CSE 在肺組織中的表達[13]。有許多實驗證明內源性的 H2S 在腎纖維化和肺纖維化中都是重要的保護因子。之前的實驗表明當給小鼠注射外源性 H2S 供體NaHS 時,肺纖維化會得到一定的緩解[14]。盡管如此,H2S 在這一過程中發揮保護作用的確切機制仍不清楚。

    ....................


    2、材料與方法


    2.1 主要設備與試劑

    主要設備與試劑

    ..................


    2.2 實驗動物

    2.2.1 實驗分組

    (1)八周齡雄性 ICR 小鼠 28 只,隨機分為 4 組:對照組(Control),博來霉素組(BLM),硫化氫組(H2S),博來霉素+硫化氫組(BLM+H2S),每組7 只。

    (2)八周齡雄性 C57 小鼠,八周齡 CBS+/-小鼠,每組 7 只。

    2.2.2 運動方案及藥物用量

    博來霉素用量:博來霉素粉末用 PBS 成濃度為 2.4mg/ml 的液體,小鼠稱重后按 3mg/kg 標準進行氣管內滴注。

    H2S 常用量:28uM/kg。

    按照如圖所示配置逆轉錄反應體系:

    ..........................


    3主要實驗技術.......................... 17

    3.1提取蛋白.......................... 17

    3.2蛋白質印記分析............................ 18

    3.2實時熒光定量 PCR(Real-time PCR)..........................18

    4統計學分析..............................22

    5研究結果......................22


    6.分析與討論

    特發性肺纖維化是一種致命疾病,造成肺泡結構的破壞,導致進行性功能喪失。纖維化涉及成纖維細胞過度增殖和細胞外基質的積累。 在肺中,最常見的纖維化類型是特發性肺纖維化(IPF),IPF 是一種死亡率高,治療選擇有限的疾病。一直以來,肺纖維化被認為是慢性炎癥驅動的疾病,因為在患有肺纖維化的受試者和實驗動物模型中均發現多種促炎細胞因子和趨化因子表達升高[17]。 但是,使用抗炎藥治療 IPF 的 PANTHER 試驗未能改善患者生理參數,反而導致治療組死亡率和住院率增加[18]。眾所周知,IPF 會影響肺泡 II 型上皮細胞(ATII),即肺泡肺泡單位的干細胞。 II 型肺泡(ATII)細胞可以自我更新并分化為 I 型肺泡上皮細胞,因此被認為是肺泡祖細胞[19]。但是,ATII 細胞促成 IPF 發病機理的機制仍然未知(May the mechanical force be with ATII )。

    早在 60 年前,Hayflick 和 Moorehead 就觀察到了細胞的衰老,他們發現培養中的原代人類肺細胞進行了有限的分化后便不再繼續分化,由此進入了衰老狀態[20]。細胞衰老是一種永久抑制細胞生長的狀態,與衰老和衰老相關疾病有關。有實驗結果表明,細胞衰老與包括哮喘,慢性阻塞性肺疾病和肺纖維化在內的多種肺部疾病有密切關系。如有研究發現哮喘會導致人上皮細胞中的P21/P16 表達濃度升高[21],小鼠 COPD 模型顯示,暴露在香煙中會激活 p21-PARP-1 途徑,導致 DNA 損傷并加劇細胞衰老[22],將培養的人肺上皮細胞暴露于香煙煙霧中可誘導 p21 上調并導致衰老[23],在 IPF 患者中,肺泡和支氣管上皮細胞均表達衰老標記物 p21 和 p53[24]。我們之前的實驗結果也表明,在博來霉素(BLM)誘導的肺纖維化中,肺損傷的程度會隨著時間的推移而逐漸增加,同時細胞衰老標記物 P53 和 P21 的蛋白表達也呈時間依賴性的增高。離體實驗也表明,經過 BLM 干預后,大鼠肺泡上皮細胞形態學發生了改變,較對照組的細胞增大且更加扁平,且對β-半乳糖酶染色更加敏感。我們對小鼠進行了為期 14 天的 BLM 器官滴注后對其肺組織進行熒光染色,通過上皮標記物 SPC 和 P53/P21 的共染,我們發現經過 BLM 滴注的小鼠肺組織中 P53和 P21 的表達明顯升高。這表明,BLM 誘導肺纖維化的機制可能與 ATII 的細胞衰老密切相關。

    ...............................


    7 結論

    在正常生理條件下,p53 維持在非常低的細胞水平。然而,響應于外源和內源性應激,p53 會被迅速穩定和激活。在從應激中恢復期間維持低 p53 水平或 p53 失活主要歸因于 E3 泛素連接酶 MDM2 的功能。MDM2 通過至少 3種機制控制細胞 p53 的水平和活性:(a)p53 反式激活能力的直接結合和阻斷; (b)單泛素化導致 p53 從細胞核中輸出; (c)多泛素化,導致 p53 的蛋白酶體降解[47,48]。實際上,MDM2 本身就是 p53 的直接轉錄靶標,因此形成了自動調節反饋環,因此 p53 和 MDM2 緊密調節彼此的細胞水平和活性[49.50]。將 L2 細胞分成 BLM 單獨干預和 BLM+H2S 共同干預兩組,通過免疫共沉淀實驗發現經過 H2S 干預后可以有效泛素化降解 L2 細胞中的 P53。有研究證明,在肝細胞癌(HCC)中,當對 HCC 細胞的增殖和轉移有明顯抑制作用的 miR-145 模擬物能夠在很大程度上抑制 MDM2 的表達,并隨后上調p53/p21 的表達[51]。MDM2 是一種 E3 泛素連接酶,可調節 p53 的泛素化,導致其被蛋白酶體降解[52,53,54]。此外也有多項實驗結果證明 MDM2-P53 通路參與了多種病理生理情況的調控,并成為治愈疾病的潛在靶點[55.56.57]。為了進一步驗證 MDM2 和 P53 的相互作用在硫化氫改善博來霉素誘導的肺纖維化中發生的作用,我們運用免疫共沉淀方法檢測了 BLM 單獨干預和 BLM+H2S 共同干預兩種條件下 L2 細胞中 MDM2 和 P53 相互作用程度的情況。經試驗證明,經過硫化氫干預后,L2 細胞中 MDM2 和 P53 的相互作用相較于單純使用 BLM干預的 L2 細胞有所加強。以上實驗結果說明 H2S 的作用可以加強 MDM2 和P53 之間的相互作用進而促進 P53 的泛素化降解。

    參考文獻(略)

    該論文為收費論文,請加QQ1135811234聯系客服人員購買全文
    在线成年视频人网站观看,成年美女黄网站色大全中闯,99久热re在线精品视频,又爽又黄又无遮挡的视频